辣根過(guò)氧化物酶

過(guò)氧化物酶（HRP）廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱辣根過(guò)氧化物酶（HRP），是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為pH 3-9，催化反應(yīng)的最適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。

酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275

純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標(biāo)記。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)記。HRP的作用底物為過(guò)氧化氫，催化反應(yīng)時(shí)的供氫體有幾種：⑴鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時(shí)內(nèi)不改變,是目前國(guó)內(nèi)ELISA中最常用的一種；⑵聯(lián)大茴香胺（OD），產(chǎn)物為橘黃色，最大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；⑶5－氨基水楊酸(5－AS）：產(chǎn)物為深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性較差；⑷鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍(lán)色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應(yīng)快，顏色明顯。

堿性磷酸酶

系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個(gè)同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價(jià)無(wú)毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應(yīng)系統(tǒng)中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個(gè)單位。

標(biāo)記方法

良好的酶結(jié)合物取決于兩個(gè)條件：即高效價(jià)的抗體和高活性的酶。抗體的活性和純度對(duì)制備標(biāo)記抗體至關(guān)重要，因?yàn)樘禺愋悦庖叻磻?yīng)隨抗體活性和純度的增加而增強(qiáng)。在酶標(biāo)記過(guò)程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價(jià)高及抗原親和力強(qiáng)的抗體球蛋白，最好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。

酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過(guò)碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標(biāo)記抗體的改良過(guò)碘酸鈉法簡(jiǎn)單易行，標(biāo)記效果好，特別適用于實(shí)驗(yàn)室的小批量制備。其標(biāo)記程序?yàn)椋簩?span>5μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L的過(guò)碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml，混勻置4℃冰箱30分鐘 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘后加入含5g純化抗體的水溶液1ml，混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(shí)（或過(guò)夜）使之結(jié)合，然后吸出，加硼氫化鈉（NaBH4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時(shí)，將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鐘后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，并對(duì)之透析過(guò)夜（4℃），次日離心除去不溶物，即得到酶標(biāo)抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進(jìn)行測(cè)定后，冷凍干燥或低溫保存。

效果測(cè)定

測(cè)定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。

⑴ 酶與抗體的活性　常用瓊脂擴(kuò)散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時(shí)，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反應(yīng)，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結(jié)合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后，瓊擴(kuò)滴度應(yīng)在1:16以上。另一個(gè)測(cè)定方法是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELISA方法進(jìn)行方陣滴定，此法不僅可以測(cè)定標(biāo)記效果，還可以確定酶標(biāo)抗體的使用濃度。

⑵ 結(jié)合物的定量測(cè)定　一般是對(duì)結(jié)合物中的酶和IgG進(jìn)行定量測(cè)定。常用紫外分光光度計(jì)于403nm和280nm進(jìn)行測(cè)定，然后按下列公式計(jì)算：

酶量（mg/ml）=OD403×0.42

IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62

對(duì)于過(guò)碘酸鈉氧化法制備的標(biāo)記抗體量，按下列公式計(jì)算：

IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62

已知酶量和IgG量后，即可計(jì)算出標(biāo)記抗體的摩爾（mol）比值。

HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4

結(jié)合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結(jié)合物溶液量

結(jié)合物產(chǎn)率=結(jié)合物中酶總量/標(biāo)記時(shí)加入的酶量×100%

用于ELISA的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時(shí)效果一般，為500(g/ml時(shí)效果較好，達(dá) 1000(g/ml時(shí)****。mol.比值由于結(jié)合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作為主要參數(shù)。一般認(rèn)為mol.比值為0.7時(shí)效果一般，1.0時(shí)效果較好，1.5-2.0時(shí)最好。酶結(jié)合率為 7%時(shí)效果一般，為9%－10%較好，達(dá)30%以上時(shí)最好。